Итачи — первый сын Фугаку и Микото, двух членов клана Учиха, одного из сильнейших кланов Конохагакуре. В четыре года, во время Третьей мировой войны шиноби, он стал свидетелем гибели огромного количества шиноби, что отразилось на его психике.Впоследствии, он задумался над смыслом существования и обратился за советом к Орочимару. Саннин сказал, что в жизни нет смысла, если она не вечна. С этого момента Итачи откололся от социума и стал уделять больше внимания обучению, нежели общению со сверстниками. Помимо этого, он сблизился с воронами.Во время нападения Кьюби на Коноху, Итачи оставался дома, и присматривал за своим, недавно родившимся, братом.Он начал интересоваться историей всего мира, не ограничивая себя лишь знаниями о деревне и клане, тем самым начиная узнавать о многих действительно важных вещах. Широкие познания позволили ему достичь понимания того, как происходили события прошлого. Также, он мог применять их и по отношению к будущему, поэтому он все больше начинал волноваться о текущем ходе вещей, и о грядущем своей родной деревни. Несмотря на свою миролюбивую натуру, он был гением и считался одним из лучших шиноби в своём поколении. Среди студентов были дети вроде Изумо Тенмы, которые обвиняли Итачи и его клан в нападении Кьюби на Коноху, но тот лишь игнорировал их. Из-за того, что он во всём превосходил своих сверстников, некоторые из них, такие как Камано Сайсу, стали завидовать. Тем не менее, защитив их от старшего хулигана, Итачи стал для них настоящим авторитетом, к собственному неудовольствию. Поскольку уроки в Академии давались ему с откровенной лёгкостью, он просил отца обучать его техникам клана. С первой попытки ему удалось в совершенстве овладеть Катон: Гоккакью но Дзюцу. Помимо этого, он тренировался со своим соклановцем Шисуи, в то время как в Академию посылал своего Каге Буншин. Узнав об этом, преподаватели поощрили его преждевременным окончанием Академии и вступлением в должность Генина. Вместе с Инари Шинко и Изумо Тенмой он стал членом команды 2 под руководством Миназуки Юки. Вместе, они выполняли различные миссии, в том числе - по поимке и возврате в семью молодого Ниннеко в Сора-ку, которого с успехом поймал Итачи, отсекая при этом часть усов кота, экстракт из которых способен вылечить отца Тенмы. В полёте за усами, Тенма едва не погиб, но его спас Итачи. Тенма, фактически, признал, под давлением Шинко, Итачи своим другом и товарищем. На миссии по церемониальной защите Даймё, на команду 2 напал таинственный человек в оранжевой маске. Он наложил Гендзюцу на охрану феодала, но Итачи и Тенме удалось преодолеть его, после чего последний атаковал врага врукопашную, за что и поплатился жизнью. Смерть товарища вызывала пробуждение Шарингана у Итачи. Однажды, Итачи победил Некомата, и попросил его сражаться с Саске в полную силу, когда тот будет на этой же миссии. Уже через два года Итачи стал Чунином.

В одиннадцать лет Итачи вступил в Анбу, а в тринадцать уже был назначен капитаном. Итачи, вместе с Какаши, был телохранителем Сандайме Хокаге, а также участвовал в защите шиноби Конохи от Ханняшу. Отец очень ценил Итачи, и верил, что его старший сын станет будущим наследником клана. Несмотря на то, что Саске старался превзойти Итачи, и видел в нём прежде всего соперника, Итачи очень любил своего брата, и искренне радовался его успехам.

После нападения Кьюби на Коноху, отношения между руководством Конохи и кланом Учиха испортились, поскольку первые считали ответственными за нападение именно их. Из-за изоляции от политики деревни, клан Учиха начал готовить государственный переворот. Правительство Конохи, узнав об этом, поручило Итачи стать шпионом в клане. После этого, он стал вести себя странно, что замечают члены клана. Из-за этого, его и стали подозревать в убийстве его лучшего друга, Шисуи, который, на самом деле, пошел на это лишь затем, чтобы защитить деревню, и передал Итачи свой Мангекё Шаринган, после чего, упал в Нака но Кава. В связи со смертью Шисуи, Итачи испытал сильную боль от потери близкого человека, и, таким образом, пробудил Мангекё Шаринган.Спустя небольшой промежуток времени, старейшины Конохи приказали Итачи убить всех членов его клана. Данзо дал ему выбор: или он присоединится к клану, и умрёт вместе с ним, или поможет уничтожить его, и спасет своего брата и свою деревню В эту же ночь, Итачи встретил Учиха Обито под именем Учиха Мадара, который помог ему уничтожить клан, в обмен на то, что Итачи вступит в его преступную организацию, Акацки, а он не тронет Коноху и Саске.Вскоре, он и Тоби собственноручно вырезали весь клан. Итачи лично взялся за убийство своих родителей. Несмотря на его предательство, они не держали зла на него. Вместо этого, за миг до своей смерти, они сказали ему, что гордятся своим сыном, и попросили позаботиться о Саске. В ту ночь, Саске пришёл домой поздно, и увидел убитых членов клана, в том числе, и своих родителей. Позже, Итачи, как и его брат, был в доме, и сказал ему, что он убил всех только для того, чтобы проверить свои способности. Используя Тсукуёми, он заставил Саске прочувствовать устроенную им резню. Он объяснил брату, что не убил его лишь для того, чтобы тот пробудил Мангекё Шаринган, и сразился с ним через некоторое время, добавив, что для этого, он должен ненавидеть его, и жить ради мести. Уходя, Итачи был удивлён, когда Саске тут же отправился в погоню за ним, сорвав бандану-протектор с головы Итачи. Одновременно с этим, его младший брат пробудил Шаринган, однако, из-за полученного шока потерял сознание. Увидев это, Итачи поддался эмоциям и заплакал. Перед тем, как покинуть родину, Итачи послал своего замаскированного клона на встречу с Данзо. Под угрозой выдать секреты деревни вражеским ниндзя, он напомнил ему о его обещании не трогать Саске. После этого, он посетил Сандайме Хокаге и доложил о завершении свой миссии, к большому сожалению последнего. Итачи попросил Сандайме присмотреть за Саске, и тот пообещал ему это.

После ухода из Конохи, он вступил в организацию Акацки, в первую очередь для того, чтобы удержать их от нападения на Коноху. Итачи познакомился с Хошигаки Кисаме. Во время их знакомства, Кисаме понял, насколько силён и умён Итачи, и стал для него не просто напарником, но и товарищем. С тех пор, Кисаме стал всюду следовать за Итачи, и постоянно прислушивался к его мнению, считая Итачи своим наставником. После вступления в организацию, он стал жертвой Орочимару. Орочимару попытался забрать его тело из-за Шарингана, однако, ему это не удалось, и Итачи победил его в бою, отрубив руку Саннина. Чтобы найти замену Орочимару, Итачи помог завербовать Дейдару, чьё искусство он одолел с помощью Додзюцу Шарингана. С тех пор, Дейдара поклялся отомстить Итачи за это унизительное поражение.В неизвестный момент истории Итачи подхватил неизлечимую смертельную болезнь. На протяжении многих лет, он держался за счёт одних лишь лекарств и чистой силы воли, чтобы прожить достаточно долго для смерти от руки Саске.

После нападения Орочимару на Коноху, Итачи и Кисаме появляются в деревне. Они собираются похитить Наруто, чтобы извлечь Биджу. Однако, попытка заканчивается неудачей, так как в это время Наруто не находится в деревне. После этого, Хатаке Какаши замечает их во время их нахождения в Ресторане Данго, однако, они быстро исчезают.Они отправляются за Наруто, но на их пути появляются Джонины из Конохи — Сарутоби Асума и Юхи Куренай. Начинается сражение. Джонины оказываются в невыгодном положении против Итачи и Кисаме. Им на выручку приходит вовремя подоспевший Какаши, и сражается с обоими противниками.Какаши терпит поражение, однако, его сменяет Майто Гай, и защищает товарищей. Кисаме заинтересовывается в продолжении сражения с ним, однако, Итачи останавливает его, говоря, что у них есть другие планы.Затем, Итачи и Кисаме находят Наруто. Они предлагают ему пойти с ними, однако, Итачи замечает появившегося Саске. Тот собирается убить старшего брата, но Итачи ломает ему кисть. В следующее мгновение, появляется Джирайя, и изменяет ход битвы.Итачи приказывает Кисаме уходить, так как они имеют дело с сильным противником. При помощи Аматерасу, они сбегают из желудка жабы. Итачи объясняет Кисаме их побег тем, что ему нужен отдых.
Итачи, как и все члены Акацки, присутствует на собрании организации, где обсуждается, что Орочимару взял под свою опеку Саске. Также, обговариваются дальнейшие действия организации.
Спустя два года, после похищения Джинчурики Шукаку — Гаары, являющегося Казекаге, Конохагакуре высылает на помощь своих Шиноби. Когда Команда Какаши приближается к убежищу Акацки, чтобы спасти Гаару, на их пути встает Итачи, тем самым, задерживая их до окончания запечатывания. В ходе сражения, Итачи удается поймать Наруто в одно из своих Гендзюцу. Также, ему без особого труда удается сражаться с Какаши.Тем не менее, в самый последний момент сражения, его убивает Наруто при помощи своей новой техники — Одама Расенган. Выясняется, что это была всего лишь копия Итачи, созданная лидером Акацки, в то время, как сам Итачи лишь посылал свою Чакру, для управления ею.После запечатывания Шукаку, Итачи и Кисаме отправляются искать своего Джинчурики.
Итачи, подобно другим членам организации, присутствует при запечатывании Ниби.
Кисаме удаётся победить Роши, в то время, как Итачи наблюдает за боем. Затем, он, вместе с Кисаме, относит тело Джинчурики в убежище Акацки, где они извлекают Биджу. Перед этим, лидер Акацки сообщает, что Саске убил Орочимару, а его следующей целью является Итачи. После запечатывания Йонби, Дейдара и Тоби отправляются за Саске. Позднее, до членов Акацки доходят новости, что все трое погибли. Когда Кисаме говорит Итачи, что теперь он — последний из клана Учиха, тот отвечает, что Саске всё ещё жив. Также он намекает на выжившего Учиха Мадару.
Понимая, что его конец близок, Итачи посылает своего Каге Буншин найти Наруто. Когда тот предпринимает попытку атаковать, Итачи говорит, что просто хочет поговорить. Поймав Наруто в Гендзюцу, Итачи спрашивает его, почему Саске так дорог для него. В ответ на это, Наруто говорит, что, в отличие от Итачи, он относится к Саске, как к брату, и сделает всё, чтобы вернуть его. Итачи улыбается, после чего в рот Наруто влетает ворона. Итачи объясняет это тем, что он только что передал Наруто часть своей силы.Через некоторое время, Итачи посылает своего клона навстречу Саске и его команде. Саске атакует его своим Чидори Эйсо, демонстрируя свои новые способности. Через клона, Итачи предлагает Саске сразиться с ним в последний раз, чтобы испытать его новую силу.
Итачи просит Кисаме не подпускать никого к убежищу Учиха кроме своего младшего брата. Когда Саске приходит к брату, они обмениваются Гендзюцу. По просьбе Саске, Итачи рассказывает ему о таинственном Тоби, более известном как Учиха Мадара, а также о секрете Мангекё Шарингана и Вечного Мангекё Шарингана. Итачи, будучи разочарованным, что Саске не пробудил Мангекё Шаринган, заявляет, что с помощью него он станет вторым человеком в истории, кому удастся обуздать силу Вечного Мангекё Шарингана. Обмен Гендзюцу заканчивается, когда Саске вырывается из Тсукуёми Итачи. Таким образом, начинается настоящая битва. В ходе битвы, они оказываются на крыше, где пытаются пересилить Катон: Гокакью но Дзюцу друг друга. Чтобы пересилить пламя брата, Итачи активирует Аматерасу и, казалось бы, сжигает его заживо. Тем не менее, Саске удаётся сбросить кожу и застать Итачи врасплох своими Катон: Горьюка но Дзюцу. Итачи уворачивается от атак, но Саске сообщает ему, что Итачи не был их целью.После атаки Саске, в небе формируются грозовые облака и полыхают молнии, что позволяет Саске использовать на Итачи Кирин. Хотя убежище было уничтожено, Итачи удаётся выжить благодаря Сусаноо. Под самый конец сражения, у Саске не остаётся чакры, и Орочимару, заключённый в нем, вырывается на свободу. Активировав Сусаноо, Итачи начинает медленно надвигаться на Саске. Тем не менее, Итачи запечатывает Саннина, и, понимая, что его силы на исходе, передаёт Саске часть своей силы, после чего, умирает из-за неизвестной болезни. Перед смертью, он извиняется перед Саске с улыбкой на лице.После сражения, Тоби находит Саске, и забирает его и тело Итачи. Тоби говорит Саске, что он никто иной, как Учиха Мадара. Из глаза Саске появляется Аматерасу, и перекидывается на Тоби, однако, тот выживает. Тоби говорит Саске о том, что всё, что натворил Итачи, было спектаклем, и рассказывает историю заговора клана Учиха против Хокаге. Здесь становится ясно, что Итачи всего лишь хотел защитить своего брата, и даже был готов пожертвовать собой. Сражение против Саске было трюком, с целью, с одной стороны — снять влияние Орочимару на Саске, а с другой — передать ему свою силу, и сделать героем Конохи. Узнав правду, Саске собирается уничтожить Коноху, при этом, не соблюдая волю и желание Итачи. Через некоторое время, Саске пересаживает себе глаза брата, чтобы овладеть Вечным Мангекё Шаринганом.

Якуши Кабуто добывает ДНК Итачи. Вскоре, Кабуто находит Тоби, который удивлён тем, что тот смог его найти. Тоби нападает на Кабуто, заявляя, что тот являлся шпионом Сасори, и тем самым — предателeм Акацки. Однако, Кабуто использует Кучиёсе: Эдо Тенсей, и призывает самого Итачи, вместе с Сасори, Дейдарой, Какузу и Нагато, чтобы показать Тоби свою силу, и говорит, что не намерен сражаться. Кабуто предлагает Тоби союз, и помощь в войне путём принуждения призванных им Акацки сражаться на его стороне. Взамен на это, он требует Саске для своих экспериментов. Когда Тоби прозрачно намекает на свой отказ, Кабуто призывает Учиха Мадару, которого Тоби, по-видимому, боится, и соглашается на союз.Наряду с другими членами Акацки, Кабуто возрождает Итачи с помощью Кучиёсе: Эдо Тенсей, чтобы тот сражался за Тоби против Альянса Шиноби в Четвертой мировой войне. В то время, как Какузу, Дейдара и Сасори сражаются на поле боя, Итачи и Нагато находятся у входа в комплекс, похожий на храм, и обсуждают Тоби, их нового союзника, и его планы.Позже, они встречаются с Наруто и Киллером Би. Тогда же Итачи узнаёт сразу несколько вещей: Наруто использует Кьюби Чакра Модо, что указывает на получение полного контроля над Кьюби; Киллер Би использует Самехаду, что является доказательством смерти Кисаме; Наруто рассказывает ему, что Саске вступил в Акацки и поклялся уничтожить Коноху, узнав правду об уничтожении клана Учиха. Между ними начинается сражение. Позже, Итачи активирует свой Мангекё, и изо рта Наруто появляется ворон с Мангекё Шаринганом. Таким образом, ему удаётся освободиться от контроля Кабуто, путём наложения Гендзюцу, обязывающего его защищать Коноху.Итачи присоединяется к Наруто и Би в битве против Нагато, используя на нём и его призывах Аматерасу. Впоследствии, он спасает обоих Джинчурики от Нагато. Когда тот использует Чибаку Тенсей, чтобы нейтрализовать их, трое объединяют усилия и успешно противостоят технике. Затем, Итачи запечатывает Нагато с помощью Тотсука но Тсуруги. Также, он рассказывает, что этот Мангекё в глазу ворона принадлежал Учиха Шисуи, в котором он видел те же идеалы, что и в Наруто, и он — единственный, кто может остановить Саске. Итачи сжигает ворона с глазом Шисуи, дабы не допустить его попадания в руки врага. После этого, Итачи отправляется на поиски Кабуто, чтобы остановить действие Эдо Тенсей.

По пути, он встречает Саске. Тот следует за Итачи, пытаясь понять, почему он уничтожил клан, и сохранил жизнь именно ему. Итачи объясняет это тем, что это было не только из-за любви к нему. Так как Саске был единственным Учиха, ничего не знающем о заговоре, Итачи оставил его в живых, чтобы он восстановил доброе имя клана. Итачи также отметил, что он сожалеет о пути, который выбрал Саске. Настойчивый Саске всё равно пытается добиться разговора с ним, но Итачи удаётся оторваться от него, при помощи своих ворон. Однако же, он сильно удивляется, когда Саске приходит к нему на помощь во время сражения с Кабуто. Саске решает убить Кабуто, но Итачи останавливает его, говоря, что Кабуто должен оставаться в живых для возможности отмены Эдо Тенсей. Саске предлагает свою помощь, при условии, что старший брат расскажет ему правду после боя. Итачи соглашается.Чтобы избежать попадания в Гендзюцу, Кабуто скрывается из виду. Итачи и Саске отбиваются от его атак при помощи Сусаноо. Выясняется, что Кабуто обучился входить в Сеннин Модо, после чего Итачи быстро защищает Саске от внезапной атаки их врага. В ходе сражения, Итачи напоминает Саске об их миссии по захвату кабана. Путём отличной командной работы, они успешно ведут сражение. Тем не менее, Кабуто удаётся перехватить Кусанаги Саске, которым он орудует против Итачи. Несмотря на это, Итачи забирает меч обратно и отрезает им кончик рога Кабуто.Кабуто пытается настроить Саске против Итачи, указывая ему на многолетнюю ложь старшего брата. Итачи признаёт свои ошибки, но обещает кое-что рассказать Саске после использования Изанами. Кабуто сохраняет уверенность в своей победе, так как братья не могут убить его, и из-за мер предосторожности, которые он принял, чтобы не попасться в Гендзюцу. Он манипулирует стенами пещеры, чтобы закрыть им путь к отступлению, а затем демонстрирует способности других ниндзя Ото. Таким образом, он пытается добраться до Итачи, чтобы вернуть контроль над ним. Сам Итачи в это время активно готовится к использованию Изанами.В то время, как Итачи и Саске разделываются с воссозданным Орочимару, Кабуто разрезает Итачи пополам. Как только тело Итачи восстанавливается, он использует Кусанаги Саске, чтобы вновь отрезать ту же часть рога, что и раньше. Из-за этого образуется временная петля. Внутри неё Кабуто попадает в ловушку из бесконечной битвы — это и есть Изанами. У Кабуто имеется шанс выбраться из Изанами, если он признает свою судьбу, за которую он пытался бороться, забирая себе способности других. Это был подарок Итачи, поскольку последний заметил сходство их судеб. Затем, Итачи погружает Кабуто в Тсукуёми, тем самым выясняя, как остановить Кучиёсе: Эдо Тенсей.Пока Кабуто формирует печати, Саске заявляет, что он не простит Коноху за тот путь, на который она толкнула Итачи, и всё равно будет стремиться к уничтожению деревни, несмотря на желания самого Итачи. Итачи выслушивает брата, но ничего не отвечает. Когда Эдо Тенсей начинает рассеиваться, он обращается к Саске и признаёт всё, что было сказано им в свой адрес, и даже передаёт некоторые свои воспоминания о нём, чтобы полностью развеять собственную ложь. Он тянется к Саске и утыкается лбом в его лоб, символизируя этим их равенство. Итачи говорит, что не требует его прощения и обещает, что всё равно будет любить его, вне зависимости от его решений. Тело Итачи рассыпается, а душа возвращается в Джодо.